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2025-04-17

ffpe核酸提取的简单方式有哪些?

FFPE样本核酸提取因样本经过特殊处理,核酸存在交联和降解情况,提取有一定难度,但也有相对简单的方式,以下为你详细介绍:
试剂盒提取法
- 原理:基于硅胶膜吸附核酸的原理。在高盐低pH值条件下,核酸会特异性地结合到硅胶膜上,而蛋白质、多糖等杂质则被洗脱去除;然后在低盐高pH值条件下,核酸从硅胶膜上解离下来,从而实现核酸的分离和纯化。
- 操作步骤
    1. 脱蜡:将FFPE切片放入离心管中,加入适量的脱蜡剂(如二甲苯),振荡混匀,离心后弃去上清液,重复2 - 3次,以彻底去除石蜡。然后用无水乙醇洗涤样本,去除残留的脱蜡剂,离心弃去乙醇,晾干。
    2. 消化:向晾干的样本中加入适量的消化缓冲液和蛋白酶K,振荡混匀,置于55 - 60℃孵育2 - 4小时或过夜,使蛋白质充分消化。
    3. 结合核酸:消化完成后,离心去除不溶性杂质,将上清液转移至新的离心管中,加入适量的结合缓冲液,混匀后转移至硅胶膜离心柱中,离心使核酸结合到硅胶膜上。
    4. 洗涤:向离心柱中加入洗涤缓冲液,离心弃去废液,重复2 - 3次,以去除杂质。
    5. 洗脱:向离心柱中加入适量的洗脱缓冲液,室温放置2 - 5分钟后离心,将核酸洗脱到收集管中。
- 优点:操作简单、快速,一般在2 - 3小时内即可完成提取;试剂盒中配备了所需的各种试剂和耗材,无需自行配制,减少了操作误差;提取的核酸纯度较高,可满足大多数后续实验的需求。
- 适用场景:适合大规模样本的提取,以及对操作简便性和提取效率要求较高的实验室。
磁珠法
- 原理:利用磁珠表面的特殊化学基团与核酸之间的亲和力,在特定的缓冲液条件下,核酸会吸附到磁珠表面。通过外加磁场,可以将磁珠与溶液分离,然后经过洗涤和洗脱步骤,即可得到纯化的核酸。
- 操作步骤
    1. 脱蜡和消化:与试剂盒提取法的脱蜡和消化步骤相同。
    2. 结合核酸:向消化后的上清液中加入适量的磁珠和结合缓冲液,混匀后室温孵育一定时间,使核酸充分结合到磁珠上。
    3. 分离磁珠:将离心管置于磁力架上,静置片刻,待磁珠吸附到管壁上后,小心弃去上清液。
    4. 洗涤:向离心管中加入洗涤缓冲液,混匀后再次置于磁力架上,弃去上清液,重复2 - 3次。
    5. 洗脱:向离心管中加入适量的洗脱缓冲液,混匀后室温孵育一定时间,然后置于磁力架上,将上清液转移至新的离心管中,即为提取的核酸。
- 优点:操作简便,可实现自动化提取,适合高通量样本的处理;磁珠与核酸的结合特异性高,提取的核酸质量好;提取过程中不需要离心,减少了样本的损失。
- 适用场景:适用于自动化程度较高的实验室,以及需要处理大量样本的科研机构和临床检测中心。