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2025-04-17

磁珠法ffpe核酸提取的注意事项

磁珠法FFPE核酸提取具有操作简便、可自动化等优点,但在操作过程中有诸多注意事项,以下从样本、试剂、操作过程、质量控制等方面为你详细介绍:

样本相关注意事项
- 样本选择与保存
    - 尽量选取新鲜、固定良好且无明显坏死、自溶或污染的FFPE样本。因为受上述不良因素影响的样本,核酸质量会下降,影响后续提取效果。
    - FFPE样本需保存在干燥、阴凉处,长期保存可置于 -20℃冰箱,防止核酸进一步降解。
- 切片处理
    - 切片厚度以5 - 10μm为宜。过厚切片会增加脱蜡和消化难度,降低核酸提取效率;过薄切片则可能导致核酸含量不足。
    - 切片过程要避免交叉污染,使用干净的刀片和载玻片。

试剂相关注意事项
- 试剂选择与保存
    - 选用质量可靠、经过验证的磁珠法核酸提取试剂盒,不同品牌试剂盒的试剂成分和性能可能存在差异,应根据实验需求和样本特点进行选择。
    - 严格按照试剂说明书的要求保存试剂,多数试剂需在2 - 8℃冷藏保存,部分试剂需避光或冷冻保存。避免试剂反复冻融,以免影响其性能。
- 试剂配制与使用
    - 若试剂需要自行配制,应严格按照配方和操作步骤进行,确保试剂的浓度和pH值准确无误。
    - 使用试剂前,要充分混匀,确保试剂成分均匀分布。同时,注意试剂的有效期,过期试剂不得使用。

操作过程注意事项
- 脱蜡环节
    - 常用脱蜡剂有二甲苯、氯仿等,需根据实际情况选择合适的脱蜡剂。脱蜡一般进行2 - 3次,每次5 - 10分钟,确保石蜡完全去除。
    - 脱蜡后用无水乙醇冲洗样本,去除残留脱蜡剂,离心弃去乙醇后要充分晾干,避免残留乙醇影响后续消化和核酸结合。
- 消化步骤
    - 蛋白酶K的用量和消化时间要根据样本大小和数量合理调整。一般消化温度为55 - 60℃,时间为2 - 4小时或过夜。消化过程中可适当振荡或搅拌,提高消化效率。
    - 消化缓冲液要选择合适的,其pH值和离子强度应适合蛋白酶K的活性,且含有适量螯合剂(如EDTA),抑制核酸酶活性,保护核酸。
- 磁珠操作
    - 磁珠使用前要充分混匀,确保磁珠均匀分散。吸取磁珠时,要使用合适的移液器吸头,避免磁珠吸附在吸头上导致损失。
    - 在磁珠与核酸结合、洗涤和洗脱过程中,要严格按照操作时间和条件进行。结合时间过短,核酸结合不充分;洗涤次数过多或时间过长,可能导致核酸损失;洗脱时间不足,则核酸洗脱不完全。
    - 每次使用磁力架分离磁珠时,要确保离心管放置平稳,静置时间足够,使磁珠充分吸附到管壁上,然后小心吸取上清液,避免吸到磁珠。

质量控制注意事项
- 核酸浓度和纯度检测
    - 提取的核酸要进行浓度和纯度检测,常用紫外分光光度法、荧光定量法等。一般DNA的A260/A280比值应在1.8 - 2.0之间,RNA的A260/A280比值应在2.0 - 2.2之间。若比值不在此范围内,可能存在蛋白质、盐离子等杂质污染。
- 核酸完整性检测
    - 对于DNA,可通过琼脂糖凝胶电泳检测其完整性;对于RNA,可通过变性琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳检测。若核酸完整性较差,可能会影响后续的PCR、测序等实验结果。

环境与安全注意事项
- 操作环境
    - 整个提取过程要在清洁、无菌的环境中进行,避免核酸酶污染。实验台面、移液器等实验器具要定期用核酸酶抑制剂处理。
    - 操作过程中要佩戴口罩、手套等防护用品,防止交叉污染和试剂对人体的伤害。
- 废弃物处理
    - 实验过程中产生的废弃物,如脱蜡剂、废液、用过的吸头和离心管等,要按照相关规定进行处理,避免对环境造成污染。