FFPE样本：石蜡包埋组织切片样本。其特点是能够较长时间地保持细胞病理的原始状态，因此被广泛应用于常规的组织学分析、分子细胞的基因表达分析以及临床病理检验、肿瘤基因检测等多个领域。但FFPE样本因其在制备和储存过程容易使组织中的核酸发生不同程度的降解和分子间的交联，石蜡的高温渗入过程进一步加速核酸的降解，因此获得高质量的FFPE 核酸（DNA/RNA）产物，对下游检测极为重要。

那么哪些因素会影响FFPE样本核酸（DNA/RNA）提取质量呢？

一、样本自身影响

1、样本保存时间。如果想要获得大片段的DNA或者RNA产物，新鲜组织样本是最好的，如果是FFPE样本最好选择当月包埋的样本，保存时间越长，核酸降解越严重。可从以下图片（图一）直观感受，当月包埋的组织样本片段大多集中在1000bp，保存12个月后的样本片段大多集中在500-600bp，保存24个月后的样本片段大多集中在500bp左右。由此可见，FFPE样本保存时间越短，片段完整性越高。

图一

2、切片厚度。FFPE样本切片的厚度对于核酸（DNA/RNA）提取也有影响。切片太薄可能导致核酸损伤，而太厚则可能影响脱蜡及蛋白酶K消化的彻底性，从而降低核酸得率‌。

3、固定时组织的厚度。这对RNA的质量影响较明显。较厚的组织在包埋后提取的RNA质量较差，这可能是因为较厚的组织在固定和包埋过程中更容易受到损伤，导致RNA降解‌。如下图（图二）所示：包埋后几天从大块样本包埋（约 1 cm厚） FFPE 样本中纯化的 RNA对比小块样本包埋（约3-4mm厚），RNA断裂严重。

图二

4、包埋固定时间过长。虽然长时间的固定不直接导致RNA片段化，但会影响RT-PCR产物的长度（如图三）。即使在福尔马林中固定72小时后，RNA也仅出现少量断裂，核糖体RNA条带仍然基本完整，从而表明与甲醛本身的反应不会引起核酸断裂。相反，RT-PCR 结果表明，长时间固定会加剧甲醛修饰对 cDNA 合成的负面影响。

图三：固定时间对RNA完整性和RT-PCR性能的影响

二、提取过程影响

1、脱蜡不彻底。因为FFPE样本的特殊性，石蜡会阻碍消化液对组织的渗透，抑制蛋白酶K对组织内蛋白质的消化，从而影响核酸的释放。为消除石蜡对核酸提取和PCR扩增的不良影响，对组织进行彻底的脱蜡十分重要。传统的脱蜡方式为二甲苯脱蜡，二甲苯脱蜡不仅容易造成核酸片段化和得率低，而且对人有毒害，切片越厚或存放时间越长，脱蜡效果越差。目前市面上主流方法是采用无毒脱蜡剂。

2、蛋白酶K消化时间过短。为了将核酸与结合的蛋白质分离，FFPE样本需经受高温和蛋白酶K消化。蛋白酶K可以消化蛋白质组分以及样品中可能存在的任何核酸酶，这个步骤还可防止核酸发生降解。对消化时间进行优化十分重要，消化的时间过短，核酸释放不充分，导致核酸提取得率低。因此，消化时间需根据组织类型、组织大小进行调节，使核酸充分释放。

3、解交联处理不充分。由于FFPE样品包含的核酸（DNA/RNA）分子会彼此交联，并和蛋白质分子交联（如图四），故这些交联必须断裂，才能释放出核酸，用于后续纯化。建议高温孵育以达到逆转交联的目的。

图四：分子之间交联示意图

可见，要从FFPE样本中获得高质量核酸（DNA/RNA）产物，受以上诸多因素影响，不仅需要考虑样本自身因素，还需要注意提取过程中操作步骤和条件，并采取相应的措施来优化实验条件，以获得高质量产物。

新百基自2014年成立以来，一直致力于核酸提取试剂的研发、生产。在FFPE样本核酸（DNA/RNA）提取方面，经验丰富。旗下产品：FFPE DNA提取试剂盒（M2015）、FFPE RNA 提取试剂盒（N1004）、FFPE DNA/RNA 共提试剂盒（N1006）具有高纯，高得率，操作简便，安全环保（无需脱蜡处理）等特点。只需按照试剂盒操作流程即可轻松从样本中得到DNA或者RNA，让实验变得轻松愉悦。

数据展示

RNA产物浓度检测及电泳检测结果图

DNA产物浓度检测及电泳检测结果图