在分子生物学实验室里，提取出DNA后，研究人员做的第一件事往往不是进行精密的PCR或测序，而是用一个看似简单的仪器——紫外分光光度计——对样本进行快速检测。屏幕上跳出的两个关键比值：A260/A280和A260/A230，就像DNA样品的“健康体检报告”，瞬间揭示了其纯度和质量。这背后的科学原理是什么？这两个数字究竟诉说了怎样的故事？

1.A260、A280、A230 到底是怎么来的？

核酸（包括DNA 和 RNA）的嘌呤和嘧啶具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸、和核酸在240~290 nm 的紫外波段有一个强烈的吸收峰，最大吸收值在 260 nm 左右，而蛋白质在这一区域有很弱的吸收。

蛋白质是由氨基酸组成，这些氨基酸在可见光区都没有光吸收。但是在紫外光区色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸是有吸收的。他们的最大吸收波长分别是279、278、259 nm。当用紫外光度法测定这些氨基酸的含量的时候，蛋白质在 280 nm 处的紫外光吸收达到了最大值。

230 nm处是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长。许多在核酸提取过程中可能引入的杂质，如胍盐（离液剂）、酚、EDTA、碳水化合物以及一些离子等，对230 nm左右的紫外光有很强的吸收。

2. A260/A280 、A260/A230 有何意义？

A260/A280 、A260/A230 是核酸纯度的指示值。 纯净的样品 A260/A280 大于1.7（DNA）或者 1.9（RNA）。如果比值低于 1.7 或者1.9，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A230 表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物、盐（胍盐）等，较纯净的核酸 A260/A230 的比值大于 2.0 。

（1）当蛋白质污染时会导致A260 和 A280 的数值都下降，但 A260/280的比值变化并不显著。但蛋白残留会导致 A230 的数值显著上升，显著影响 A260/230 的比值。也就是说，如果RNA 样品的 A260/280＝1.7，A260 /230＝0.5，那么就应该考虑污染原因不是胍盐残留，而是蛋白残留。

（2）当酚污染时，酚的最大吸收峰在270 nm。酚的残留会显著的增加 A230、A260 、A280的数值，同时酚的吸收峰与核酸的吸收峰合并后，最大吸收峰向270方向偏移， 也就是说最大吸收峰在 270 nm附近。如果 RNA 样品的 A260/280=1~1.5，260/230=1~1.5，那么污染原因就应该考虑是酚残留。

（3）当胍盐污染时，胍盐对RNA 样品吸收有显著影响，会在小于 230 nm处产生大的吸收峰。胍盐残留不会影响 260 和 280 的数值，对 260/280 的比值不会造成大的影响，当然也不影响RNA定量。但胍盐残留对 A260/230 比值具有明显影响。比如 A260/230 的比值小于 0.21 时，A260/280 的比值还>1.9。也就是说，如果 RNA 样品的 A260/280>=1.9，A260/230<1，那么污染原因就应该考虑是胍盐残留。

（4）当A260/230<1 时，只有两种情况。一是胍盐污染，二是蛋白污染。

3.一份完整的DNA或者RNA“诊断书”

纯DNA：通常A260/A280 ≈ 1.7 - 1.9；纯RNA：通常为A260/A280 ≈ 1.9-2.2，表明蛋白质污染水平可接受。A260/A230 ≥ 2.0：表明杂质小分子和盐类污染物已被有效去除。

4.方法的局限性

尽管紫外分光光度法快速简便，但它也有局限：

（1）无法区分DNA和RNA：两者在260 nm都有强吸收。

（2）无法判断完整性：无法告诉你DNA是长链还是已降解成碎片。这需要琼脂糖凝胶电泳来补充判断。

（3）对极低浓度不敏感：通常需要至少几纳克/微升的浓度才能准确测量。

（4）无法检测所有污染物：某些污染物可能没有特征紫外吸收。

因此，在研究中，常将紫外分光光度计读数与凝胶电泳结果结合，对DNA样品的浓度、纯度、完整性进行三位一体的全面评估。

5.实验小tip

用分光光度计测量DNA或者RNA 时，用水而不是用 TE 缓冲液稀释样本，会造成 A260/A280 比值下降。原因是低离子强度和低 pH 溶液会增加 280 nm 处的光吸收值。

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